免疫组化技术的基本内容及常见问题和处理方法

免疫组化（IHC）是一种广泛应用于病理诊断和科研的技术，通过抗原-抗体反应定位组织中的特定蛋白质。但在实验过程中常会遇到各种问题，以下介绍免疫组化方法的基本内容及常见问题和处理方法

应用免疫学基本原理

抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry, ICC)。

免疫组化的分类

按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、荧光标记和放射性标记等。

按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。

按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法等。SP法是比较常用的方法；聚合物连接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。

可被检测的物质

  组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

免疫组化方法的基本步骤

组织和细胞的处理；抗原修复；染色。

例：二步法（Envision系统）

脱蜡、水化组织切片；根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理；0.3%或3%H₂O₂去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗；滴加一抗，室温或37℃孵育30-60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次；滴加enhancer增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟，PBS或TBS浸洗3分钟×5次；滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温或37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次；应用DAB 溶液显色；蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。

常见问题及处理方法

   无染色或信号弱

   可能原因：抗体失效或浓度过低；抗原修复不充分（如甲醛固定过度）；

组织处理不当（固定、脱水不充分）；显色时间过短或试剂失效（如DAB过期）。

解决方法：验证抗体有效性（阳性对照）；优化抗原修复条件（热修复：高压/微波；酶修复：胰蛋白酶）；延长固定时间（通常10%中性福尔马林固定6-48小时）；调整抗体孵育时间/浓度。

非特异性染色（背景高）

  可能原因：抗体交叉反应或浓度过高；内源性过氧化物酶/碱性磷酸酶未阻断（如红细胞、粒细胞）；组织干燥或切片过厚；封闭不充分（常用BSA或正常血清封闭）。

  解决方法：降低抗体浓度或更换特异性更高的抗体；用3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶（30分钟）；避免切片干燥，优化封闭步骤（封闭血清与二抗同源）。

染色不均匀

  可能原因：抗体覆盖不均或孵育环境不稳定（如温度波动）；组织折叠或气泡残留；修复液pH不一致（如EDTA vs. 柠檬酸盐缓冲液）。

  解决方法：使用免疫组化笔圈定区域，确保抗体覆盖完整；孵育时保持湿度（湿盒）；选择适合的修复液（酸性抗原用柠檬酸盐，碱性抗原用EDTA）。

假阳性（异常定位）

  可能原因：抗体与非靶蛋白结合（如坏死细胞释放的抗原）；边缘效应（切片边缘染色过深）；自发荧光（荧光IHC中常见）。

解决方法：设置阴性对照（如用PBS替代一抗）；避免切片边缘干燥，优化封片操作。

关键步骤注意事项

样本固定：新鲜组织尽快固定（离体30分钟内），避免自溶；固定时间过长可能导致抗原掩蔽，需延长修复时间。

抗原修复：热修复：高压锅（121℃）或微波（92-98℃）更彻底，但需防止沸腾过度；酶修复：适用于某些脆弱抗原（如用胰蛋白酶37℃消化10分钟）。

抗体选择： 一抗种属与二抗匹配（如兔源一抗需用抗兔二抗）；多克隆抗体敏感性高但易交叉反应，单克隆抗体特异性更好。

显色控制：DAB显色时镜下监控，避免过深（棕色）或过浅。

结语

  免疫组化的核心是 “条件优化” 和 “对照验证”。遇到问题时，需逐步排查样本处理、抗体、修复和检测系统等环节。建议记录每次实验参数，便于追溯分析。